Η Αθήνα μάχεται κατά των Μακεδόνων σε όλη τη διάρκεια της βασιλείας του Φιλίππου. Η ήττα όμως των συνασπισμένων νοτιοελλαδικών δυνάμεων στη Χαιρώνεια (338 π.Χ.) σηματοδοτεί το τέλος της ανεξάρτητης εξωτερικής πολιτικής της πόλης. Μετά την καταστροφή της Θήβας (336 π.Χ.) και την κατάκτηση της Ανατολής από τον Αλέξανδρο, η Αθήνα αναγκάζεται να παραμείνει πιστή στους Μακεδόνες. Το 322 π.Χ. όμως εξεγείρεται, αλλά ηττάται και χάνει την ανεξαρτησία της. Έκτοτε, και για όλο το διάστημα του 3ου αι. π.Χ., παραμένει υποτελής στους Μακεδόνες. Την περίοδο αυτή ιδιαίτερο ρόλο στα πράγματα της πόλης διαδραματίζει ο Δημήτριος ο Πολιορκητής. Χτίζει την ελληνιστική Πύλη, ενώ προσθέτει τον ίδιο και τον πατέρα του στους αρχικούς 10 Επωνύμους Ήρωες της πόλης.
Η απελευθέρωση της Αθήνας έρχεται γύρω στο 220 π.Χ., όταν ο Μακεδόνας φρούραρχος Διογένης πείθεται να δωροδοκηθεί και να εγκαταλείψει τη θέση του. Στα τέλη του 3ου αι. π.Χ. η Αθήνα συμμαχεί με τη Ρώμη κατά των Μακεδόνων. Ανεξάρτητη έκτοτε, γνωρίζει πραγματική πολιτισμική και αρχιτεκτονική αναγέννηση στα μέσα του 2ου αι. π.Χ., χάρη στη συνδρομή των ελληνιστικών βασιλείων της Αιγύπτου, της Συρίας, της Περγάμου, της Καππαδοκίας και του Πόντου. Είναι η εποχή που η Αγορά πήρε την τελική ορθογώνια μορφή της με τη διαμόρφωση εκτεταμένων κιονοστοιχιών στην περίμετρό της. Κιονοστοιχία συνεχής διατρέχει την πρόσοψη των μνημείων της δυτικής πλευράς, ενώ η νότια πλευρά κοσμείται με μια σειρά μεγαλόπρεπα κτήρια, τη Μέση Στοά (180 π.Χ.), τη Νότια Στοά ΙΙ (150 π.Χ.) και το Ανατολικό Κτήριο (150 π.Χ.). Στη δυτική πλευρά κατεδαφίζονται τα κτήρια που υπήρχαν και ανοικοδομείται η Στοά του Αττάλου.
Στην ίδια περίοδο ξαναχτίζεται το Μητρώο, αντικαθιστώντας το ταπεινό πλέον Παλαιό Βουλευτήριο. Περιστύλια, περίβολοι και πλήθος αναθηματικών αγαλμάτων και μνημείων ολοκληρώνουν τη διακόσμηση της πλατείας. Η Αγορά της Αθήνας ακολουθεί τα πολεοδομικά πρότυπα των μεγάλων μητροπόλεων της Ασίας (Πέργαμος), αλλά και των μικρότερων, αλλά εξαιρετικά επιτυχημένων νέων βασιλικών κτήσεων (Πριήνη, Άσσος).
Σημαντικό πλήγμα για την ελληνιστική Αθήνα υπήρξε η καταστροφή της από την επιδρομή του Ρωμαίου στρατηγού Σύλλα, ο οποίος πολιόρκησε και κατέλαβε την πόλη το 86 π.Χ. Το μεγαλύτερο τμήμα της νότιας πλευράς της Αγοράς καταστράφηκε ολοσχερώς. Η περιοχή χρησιμοποιήθηκε στο εξής κυρίως για βιοτεχνικές δραστηριότητες (κεραμική, μεταλλοτεχνία, μαρμαρογλυπτική κ.ά.). Ωστόσο, και άλλα κτήρια υπέστησαν σοβαρότατες ζημιές, αλλά επισκευάστηκαν.
